Evaluación del mecanismo de acción antimicrobiana del péptido 35409 sobre E. coli ML 35 (ATCC 43827)
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2015-10-22
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Introducción: Los péptidos antimicrobianos (PAMs) naturales han surgido como una respuesta al gran aumento de resistencia antimicrobiana de un amplio espectro de microorganismos. Sin embargo, diferentes cambios en las propiedades fisicoquímicas y estructurales de los PAMs han sido introducidas para mejorar la selectividad y disminuir la toxicidad sobre células de mamíferos. Antecedentes: En estudios realizados en la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia - FIDIC se encontró que al modificar la secuencia del péptido Pf-Rif 20628 con actividad
hemolítica, se obtiene el péptido análogo 35409 (11KA) que presenta una baja actividad hemolítica e inhibe el crecimiento de bacterias E. coli a una concentración mínima inhibitoria de 22μM. A partir de ésta información, en este trabajo, se determinó el mecanismo de acción
del péptido sintético 35409 sobre la cepa bacteriana Gram-negativa ML-35. Metodología: Inicialmente se evaluó el efecto bacteriostático y/o bactericida del péptido sobre las bacterias mediante conteo de placa. A partir de esta información se establecieron dos posibles blancos de acción: la membrana celular y el ADN bacteriano. Mediante ensayos de
liberación de calceína sobre liposomas de composición lipídica variable y microscopía electrónica de barrido con bacterias y esferoplastos se determinó la acción del péptido sobre la membrana, mientras que, ensayos de retraso de movilidad electroforética de ADN y de filamentación fueron usados para evaluar la acción del péptido sobre el ADN bacteriano. Resultados: Los resultados muestran que el péptido 35409 disminuye en un logaritmo la concentración bacteriana, mientras el resto de la población se recupera en ausencia de péptido. Esta función es ejecutada por la acción del péptido sobre la membrana bacteriana donde se da una interacción con los fosfolípidos de superficie, principalmente con la fosfatidiletanolamina, lo que permite la inserción del péptido al interior de la célula y su interacción con el ADN
bacteriano inhibiendo la síntesis de ADN y la división celular en la cepa Gram-negativa de E. coli ML35. Conclusiones: La membrana celular y el ADN bacteriano se establecieron como los principales blancos de acción del péptido 35409 sobre la cepa ML35 (ATCC 43827). Se identificó la pared celular como una barrera para la interacción del péptido con la membrana interna de la bacteria. Se sugiere que el péptido 35409 presenta una actividad dual bacteriostática y bactericida, que es un buen candidato como agente terapéutico y que podría ser útil como plantilla para la síntesis de nuevos péptidos más cortos y efectivos. Este estudio
permite establecer la base metodológica para estudiar y comparar péptidos modificados de forma rápida y sencilla, con el fin de encontrar una lógica en la secuencia de aminoácidos.
Resumen
Introduction: Natural antimicrobial peptides (AMPs) have emerged as a response to the large increase of antimicrobial resistance from a broad spectrum of microorganisms. However, numerous changes in the physicochemical and structural properties of the AMPs have been
introduced to improve their selectivity and decrease its toxicity on mammalian cells. Background: Studies in the Fundación Instituto de Inmunología de Colombia - FIDIC found that by modifying the peptide sequence Pf-Rif 20628 with hemolytic activity the analog peptide
35409 (11KA) is obtained, which has a low hemolytic activity and inhibits the growth of E. coli bacteria to a minimum inhibitory concentration of 22μM. From this information, in this paper, the mechanism of action of synthetic peptide 35409 on Gram-negative bacterial strain ML-35 was determined. Methodology: Initially the bacteriostatic and/or bactericidal effect of the peptide on bacteria
by plate count was evaluated. From this information, two possible targets of action were established: the bacterial cell membrane and DNA. By testing calcein release of liposomes of varying lipid composition and scanning electron microscopy with bacteria and spheroplasts
action of the peptide on the membrane was determined; meanwhile retardation assays of electrophoretic mobility of DNA and filamentation were used to evaluate the action of the peptide on bacterial DNA.
Results: The results show that the peptide 35409 decreases by one logarithm the bacterial concentration, while the rest of the population is recovered in the absence of peptide. This function is performed by the action of the peptide on the bacterial membrane where an
interaction occurs with the surface phospholipids, mainly with phosphatidylethanolamine, allowing the insertion of the peptide at the interior of the cell and its interaction with the bacterial DNA inhibiting DNA synthesis and the cell division in the Gram-negative E. coli
ML35 strain. Conclusions: The cell membrane and bacterial DNA were established as the main targets of action of the peptide 35409 over the ML35 (ATCC 43827) strain. Cell wall was identified as a barrier to the interaction of the peptide with the inner membrane of the bacterium. It is
suggested that the peptide 35409 has a dual bacteriostatic and bactericidal activity, which is a good candidate as a therapeutic agent that could be useful as a template for the synthesis of new shorter and effective peptides. This study establishes themethodological basis for studying and comparing modified peptides quickly and easily, in order to find a logic amino acids sequence.
Palabras clave
Péptido antimicrobiano (PAM), Mecanismo de acción, Bacteriostático, Bactericida, Liposoma, Filamentación