Normalización de un método de referencia para medir transferrina deficiente en carbohidratos CDT, por HPLC en pacientes alcohólicos

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Resumen

This research has been performed within of the global initiative interested in validating the method of High Performance Liquid Chromatography (HPLC) for identification and quantification of CDT isoforms (Helander, Husa, & Jeppsson, 2003) and their application to assess this biomarker in the consumer alcoholic population in the Bogota city. We were used certified standards of blood serum obtained from Control Serum RECIPE Clinchek®. The HPLC system was A LACHROME ELITE -HITACHI chromatograph equipped with quaternary pump, UV-VIS detector, manual injector, EZChrom Elite software. The separation of CDT glycoforms was performed on a Source 15Q ® PE 4.6 / 100 anion exchange chromatography column at ambient temperature. We have used gradient elution with solvents as: (A) 10 mM Bis-Tris pH 7; (B) Bis-Tris 10 mm + Sodium Chloride (NaCl) 0.5 M, pH 6.2; (C) Bis-Tris 10 mm pH 6.2 and 0.5 M NaCl Buffer D. The HPLC system provided a good selectivity, the glicoforms of serum transferrin had a resolution factor, Rs > 1,5. The calibration curve at 470 nm was found to be linear over the range of concentrations from 0.25 % w / w and 5.09% w / w, with correlation coefficients for all major isoforms to 0.9943. The recovery percent was 99.4% and this curve showed a linear behavior with a coefficient 0.9975. The variation coefficient percent of (% CV) were below 10% (valid values for biological samples) which showed the repeatability of the method. There were not significant differences when the measurements were performed by different analysts and in different days, finding % CV <10%, which proved that the method has good reproducibility. The limits of detection and quantification were 0,24% w / w and 0,25% w / w. The serum blood samples was obtained from six hospitals and one clinic. The method was applied to the analysis of 315 blood serum samples of people between 18 and 65 years old, associated with consumer alcohol population and 50 control samples. The population with 18-24 years old were the heavy drinkers with addiction problems and the population with 35-65 years old were hazardous drinking.

Descripción

Esta investigación hace parte de la iniciativa mundial interesada en validar el método de Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) para la identificación y cuantificación de las isoformas de CDT (Helander, Husa, & Jeppsson, 2003) y su aplicación para evaluar éste biomarcador en la población consumidora de bebidas alcohólicas en la ciudad de Bogotá. Para validar el método se utilizaron patrones certificados de suero sanguíneo obtenidos de la firma RECIPE Clinchek® Serum Control. Se empleó un cromatógrafo marca ELITE LACHROME – HITACHI equipado con bomba cuaternaria modelo L-2130; detector UV-VIS modelo L2420 (λ 470 nm) inyector manual, software EZChrom Elite. Una columna de intercambio aniónico SOURCE 15Q ® PE 4.6/100. La separación de las glicoformas CDT se realizó por gradientes usando como solventes de elución: (A) Bis-Tris 10 Mm pH 7; (B) Bis-Tris 10 mm + Cloruro de Sodio (NaCl) 0,5 M, pH 6,2; (C) Bis-Tris 10 mm pH 6,2 y Buffer D NaCl 0,5 M. Se encontró para el método una buena selectividad con valores de resolución entre las bandas cromatográficas, mayores de 1,5 (Snyder, Kirkland, & Glajch, 2012). La curva de calibración a 470 nm resultó ser lineal en el intervalo de concentraciones comprendidas entre 0.25 % P/P y 5,09 % P/P, con coeficientes de correlación para todas las isoformas mayores a 0,9994. El porcentaje de recuperación fue de 99,4% y la curva de recuperación mostro un comportamiento lineal con un coeficiente de 0,9975. Los porcentajes de los coeficientes de variación (% CV) fueron menores a 10% (valores aceptados para muestras biológicas) (Duffau, Guerrero, Roa, & Rodríguez, 2010) lo cual demostró la repetibilidad del método. No se observaron diferencias significativas cuando las medidas fueron realizadas por diferentes analistas y en días diferentes, encontrándose % CV <10%, lo que demuestra que el método presenta buena reproducibilidad. Los límites de detección y cuantificación fueron de 0,24% P/P y 0,25 % P/P. El método se aplicó al análisis de 315 muestras de suero sanguíneo de personas entre 18 y 65 años, asociadas con el consumo de alcohol y a 50 muestras control. Se comprobó mediante el análisis del biomarcador CDT que a temprana edad (18-24 años) se presenta consumo de riesgo y a edades más avanzadas (35-65 años) el consumo de alcohol es crónico y perjudicial con serios problemas de dependencia.

Palabras clave

Método de referencia, Transferrina, Carbohidratos CDT, HPLC, Alcoholismo

Materias

Licenciatura en Química - Tesis y Disertaciones Académicas , Transferrina - Investigaciones , Transferrina - Mediciones , Alcoholismo - Investigaciones

Citación