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Title: Caracterización preliminar de la enzima Dihidroorotato Deshidrogenasa de la especie Solanum Tuberosum como estrategia para el control del patógeno Phytophthora Infestans
Author: Fuentes Suárez, Luis Eduardo
Ramírez Callejas, Paola Catherine
Advisor: Zimmermann, Barbara H.
Narváez, Heidy
Ayala, Adis
Subjects: Licenciatura en Química - Tesis y disertaciones académicas
Dihidroorotato deshidrogenasa
Solanum tuberosum
Phytophthora Infestans - Control químico
Keywords: Blanco
Solanum tuberosum
Phytophthora infestans
Truncación
Clonación
Estrategia
Date: 2-Feb-2018
Abstract: The potato-solanum tuberosum-is a species belonging to the family of solanaceous that is cultivated in more than 100 countries, which makes it one of the most important crops worldwide. According to the food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), the potato is located in the fourth place of crops most importantly as a foodstuff after rice, wheat and corn. Potato crops, as well as other crops, are subject to attacks by microorganisms which are causing serious diseases that cause economic and production losses. The Oomycete Phytophthora infestans (P. Infestans), is the microorganism that causes late blight, which is one of the diseases of greater prevalence and severity in solanaceous crops, within which are plants of agricultural and economic importance like the potato and the tomato. By the summer of 1845, late blight disease attacked potato crops, spreading throughout Europe, with Ireland being one of the hardest hit countries. The disease spread uncontrollably in the following years, generating the well-known "Irish Famine" that resulted in the deaths of one and a half million Irish peasants and the exodus of a large part of this population to countries like the United States and Canada. Recently, studies with parasites of phylum apicomplexa have shown that the metabolic pathway of pyrimidines, specifically the synthesis of novo, may become a potential target for the inhibition of different pathogens, because the nucleotides of pyrimidines are involved in several critical cellular processes and perform structural, metabolic and regulatory functions. Currently some enzymes of this route of synthesis are important in the study of the inhibition of these pathogens, as is the case of toxoplasma gondii, causing toxoplasmosis, which has been evidence that parasites in the absence of the enzyme CPSII (An enzyme that catalyzes the first reaction of the route) loses its virulence; hence the importance of this research in the inhibition of pathogens as P. Infestans in hosts as S. Tuberosum. Therefore, studies highlight the importance of the enzyme DHOD because it catalyzes the only redox stage of the pathway, so it would be of great importance the kinetic and functional characterization of the enzymes of both the pathogen (PiDHOD) and the host (StDHOD). Thanks to previous work, carried out by the research group BBMP (Biochemistry and Molecular Biology of parasites) of the University of the Andes, already has the kinetic characterization of the PiDHOD, however, it has not been characterized StDHOD because the complete recombinant protein is highly hydrophobic and therefore insoluble after being induced under osmotic stress. That is why, this research aimed to characterize in preliminary form the enzyme DHOD of the species S. tuberosum, by cloning and expression of three truncated versions of this in the vector of expression pET-19b, in order to obtain a version and preserving its biological activity for its subsequent enzymatic characterization. For which it was carried out through a bioinformatic analysis the determination of the region N '-terminal to be suppressed, from this were carried out three independent truncations of the protein, Delecionando the first 69.73 and 76 amino acids called AST, DEA and TFC respectively; Which were cloned in the vector PET-19b, expressed in cells of BL21- odonPlus (DE3) RP of E. coli, then were purified by affinity chromatography using cobalt resins. Finally, the respective kinetic characterization was performed, by means of the Spectrophotometer DU 800 (Coulter Beckmann) Evaluating the reduction reaction of the 2.6 diclorofenolindofenol (DCIP), of blue color, in a reaction coupled to the dihidroorotato substrate (L-DHO) through the oxidation of the substrate of quinone (QD) that changes to colorless, which allowed to obtain the saturation curves of each of the substrates of the StDHOD (L- HO and QD) and to calculate by means of the Michaelis-Menten equation The most relevant kinetic constants for the two versions that were more likely to preserve enzymatic activity (AST and DEA): Km and Vmax (Recombinant enzyme AST KmL-DHO: 23.65 µ m, KmQd: 22.85 µ m, and VmaxL-DHO: 21.40 Μmol/mg/min VmaxQd: 20.60 Μmol/mg/ Min, whereas for the recombinant enzyme DEA, only the kinetic variables were established for the substrate L-DHO: KmL-DHO: 22.59 Μ m and VmaxL-DHO: 17.67 Μmol/mg/min and the concentration of Qd remained constant, which allowed to show that for both versions of the truncated enzymes, the Km are very close. The difference in the kinetic constants between the enzyme StDHOD and PiDHOD (KmL-DHO: 16.9 Μ m, KmQd: 6 Μ m and Vmax: 5.8 Μmol/mg/min), could be explored in the search for compounds with inhibitory capacity that had a great effect on the enzyme of the pathogen without affect the activity of the plant enzyme. In conclusion, this study opens the way for research related to the control of the pathogen P. Infestans in potato crops, strengthening the enzyme DHOD as a promising target for the inhibition of this oomycete. It is expected that this study will facilitate future research in the field of pharmacology, as well as consolidate the path of synthesis de novo de pyrimidines as a target for the control of various pathogens, such as P. Infestans, have become A harmful organism for crops of great nutritional importance for humanity.
Description: La papa-solanum tuberosum- es una especie perteneciente a la familia de las solanáceas que se cultiva en más de 100 países, lo que lo convierte en uno de los cultivos más importantes a nivel mundial. Según la organización de las naciones unidas para la alimentación y la agricultura (FAO) la papa se ubica en el cuarto lugar de cultivos con mayor importancia como producto alimenticio después del arroz, trigo y maíz. Los cultivos de papa, al igual que el resto de cultivos, están sujetos a ataques de microorganismos los cuales son causantes de graves enfermedades que provocan pérdidas económicas y de producción. El oomycete Phytophthora infestans (P. Infestans), es el microorganismo causante del tizón tardío, la cual es una de las enfermedades de mayor prevalencia y gravedad en cultivos de solanáceas, dentro de las que se encuentran plantas de importancia agrícola y económica como la papa y el tomate. Para el verano de 1845 la enfermedad del tizón tardío atacó los cultivos de papa, extendiéndose por todo Europa, siendo Irlanda uno de los países más afectados. La enfermedad se propagó sin control en los años siguientes generando la reconocida “Hambruna irlandesa” que resultó en la muerte de un millón y medio de campesinos irlandeses y el éxodo de una gran parte de esta población a países como Estados Unidos y Canadá. Recientemente, estudios con parásitos del Phylum Apicomplexa han demostrado que la ruta metabólica de Pirimidinas, específicamente la síntesis de novo, puede llegar a ser un blanco potencial para la inhibición de distintos patógenos, debido a que los Nucleótidos de Pirimidinas están involucrados en varios procesos celulares críticos y desempeñan funciones estructurales, metabólicas y reguladoras. En la actualidad algunas enzimas de esta ruta de síntesis son importantes en el estudio de la inhibición de estos patógenos, como es el caso del Toxoplasma Gondii, causante de la toxoplasmosis, del cual se ha evidenciado que los parásitos en ausencia de la enzima CPSII (Enzima que cataliza la primera reacción de la ruta) pierden su virulencia; de allí la importancia de esta investigación en la inhibición de patógenos como P. Infestans en hospederos como S. tuberosum. Por tanto, estudios resaltan la importancia de la enzima DHOD debido a que cataliza la única etapa redox de la vía, por lo cual sería de gran importancia la caracterización cinética y funcional de las enzimas tanto del patógeno (PiDHOD) como del hospedero (StDHOD). Gracias a trabajos previos, realizados por el grupo de investigación BBMP (Bioquímica y biología molecular de parásitos) de la Universidad de los Andes, ya se cuenta con la caracterización cinética de la PiDHOD, sin embargo, no se ha caracterizado la StDHOD debido a que la proteína recombinante completa es altamente hidrofóbica y por tanto es insoluble después de ser inducida bajo estrés osmótico. Es por eso, que esta investigación tuvo como objetivo caracterizar en forma preliminar la enzima DHOD de la especie S. tuberosum, mediante la clonación y expresión de tres versiones truncadas de esta en el vector de expresión pET-19b, con el fin de obtener una versión soluble y que preserve su actividad biológica para su posterior caracterización enzimática. Para lo cual se realizó mediante un análisis bioinformático la determinación de la región N’-terminal a suprimir, a partir de esto se realizaron tres truncaciones independientes de la proteína, delecionando los primeros 69,73 y 76 aminoácidos denominadas AST, DEA y TFC respectivamente; las cuales fueron clonadas en el vector pET-19b, expresadas en células de BL21-CodonPlus(DE3)RP de E. coli, luego fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad utilizando resinas de cobalto. Finalmente se realizó la respectiva caracterización cinética, mediante el espectrofotómetro DU 800 (Beckmann Coulter) evaluando la reacción de reducción del 2,6 diclorofenolindofenol (DCIP), de color azul, en una reacción acoplada al sustrato dihidroorotato (L-DHO) a través de la oxidación del sustrato de quinona (Qd) que cambia a incoloro, lo que permitió obtener las curvas de saturación de cada uno de los sustratos de la StDHOD (L-DHO y Qd) y calcular por medio de la ecuación de Michaelis-Menten las constantes cinéticas más relevantes para las dos versiones que tenían mayor probabilidad de preservar la actividad enzimática (AST y DEA): Km y Vmax (enzima recombinante AST KmL-DHO: 23,65 µM, KmQd: 22,85 µM, y el VmaxL-DHO: 21,40 µmol/mg/min VmaxQd: 20,60 µmol/mg/min, mientras que para la enzima recombinante DEA, sólo se establecieron las variables cinéticas para el sustrato L-DHO: KmL-DHO: 22,59 µM y VmaxL-HO: 17,67 µmol/mg/min y se mantuvo constante la concentración de Qd, lo que permitió demostrar que para ambas versiones de las enzimas truncadas, los Km son muy cercanos). La diferencia en las constantes cinéticas entre la enzima StDHOD y PiDHOD (KmL-DHO: 16,9 µM, KmQd: 6 µM y Vmax: 5,8 µmol/mg/min), podrían ser exploradas en la búsqueda de compuestos con capacidad inhibitoria que tuviera un gran efecto sobre la enzima del patógeno sin afectar la actividad de la enzima de la planta. En conclusión, este estudio abre el camino para investigaciones relacionadas con el control del patógeno P. infestans en cultivos de papa, afianzando a la enzima DHOD como blanco prometedor para la inhibición de este oomycete. Se espera entonces que con este estudio se faciliten futuras investigaciones en el campo de la farmacología, como también se afiance la ruta de síntesis de novo de pirimidinas como un blanco para el control de diversos patógenos que, como el P. infestans, se han convertido en un organismo nocivo para cultivos de gran importancia alimenticia para la humanidad.
URI: http://hdl.handle.net/11349/22127
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