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Title: Validación del método para la determinación de pectina en la cáscara de cacao
Author: Robayo Chaparro, Edwin Alexander
Advisor: García, Andrea Elisa
Jimenéz Sabogal, Hugo Rodolfo
Delgado Fajardo, Berta Inés
Subjects: Licenciatura en Química - Tesis y disertaciones académicas
Cascara de cacao - Pectina
Cacao - Productos derivados
Industria del cacao
Keywords: Validación
Pectina
Cáscara de cacao
Espectroscopia UV-VIS
Date: 27-Oct-2015
Abstract: Abstract This work was developed in Corpoica, its global framework which was implemented at the macro project entitled “PROTOCOLO PARA EL DESARROLLO DE PRODUCTOS CON VALOR AGREGADO PARA MERCADOS NACIONAL E INTERNACIONAL (first approximation)”. The objective of this study was to validate a visible spectrophotometric method for determining the content of pectin in the shell six different clones of Theobroma cacao L (ICS 60, TSH 565, ICS 95, EET 8, CCN 51, SCC 61) of six towns of Tolima, Huila and Santander. The study had five stages: The first one was the selection of the cacao materials, according of the state clones maturity state and appearance. In the second stage clones it was characterized using the methodology proposed by CATIE, finding that the strongest clones come from the town Algeciras. In the third stages was made the pretreatment of biological material, processed at 40°C eliminating volatile components and humidity, with the sections of cocoa dry fruit was continued to milling and screening, reducing the size of the particle to 0,5 mm for storage and codification. After was done the pectine extraction according to the methodology propose by Mollea y col. and Emaga y col. The quantification of pectin based in the methodology proposed by Blumenkrantz and Asboe-Hansen, and Ibarz and col. Finally, in the last stage of the validation, were applied the criteria according to the the Colombian technical standard NTC-ISO/IEC 17025 of 2005, which was considered the guided (appendix K) of the AOAC for the validation of botanical methods and dietary supplements for quantifying majority components. The parameters evaluated were linearity, detection limit, quantification limit, selectivity, precision and accuracy. The linearity was measured using the calibration curve with an intercept of 0, 00382, a slope of 0,00942 , a coefficient of correlation of 1,00, a determination coefficient of 1,00; also to estimate the linearity using statistical analysis the t- Student test with n-2 liberty degrees obtaining a value of 199,98 and was compared with a value t tabulated for a confidence level of 95% equal 2,776 checking the linearity of the system. The confidence limits of the slope were 0.00942±0, 0000156 and 0,00382±0,000607 in the intercept. The detection limit obtained for response of twelve blanks was 5,62 mg/L. The quantification limit was of 6,96 mg/L. The selectivity was established according the processing of specters of absorption of reagent blanks, the acid α-D-galacturonic and two clones per town, obtaining a maximum of absorption of 523 nm, for the standard and the clones. Nonetheless, for rigorous analysis, was realized the correction proposed by Kintner and Van Buren (1982) modified for measure the content of α-D-GalA in the pectine. For that a calibration curve of glucose (the only carbohydrate revealed by TLC), and based in this curve, it was constructed the correction factor obtained by the ratio of the absorbance of the blank and the absorbance generated by the concentration of Glc. The precision of the analytic method was evaluated on the system and the method of repetitive and reproducible conditions, obtaining a CV≤ 5%. The accuracy of the method was determined using the clon EET 8 from Chaparral for five copies in repeatable and reproducible conditions, obtaining a CV≤ 5. The accuracy was evaluated in the system and method. The accuracy of the system was determinated for three different concentrations of the α-D-GalA standard and was obtained a relative error less than 5% and a CV≤ 5%. For the accuracy of the method was chosen the clon CCN 51 from Villarrica for being enriched on three concentration levels, obtaining a recovery rate of 99%. Also the accuracy was estimated using t-Student, with n-1 liberty degrees for a confidence level of 95%,, concluding that test concluding that there is no significant difference between the mean obtained recovery and 100%. In the dtermination of the study matrix, first it was determinate the stability of 5FFA/MHDF complex, for knowing the reading time where the less error margin. After it was quantified in triplicate, each of the four replicates field. Finally it was realized the analysis of variance to estimate if the clones present significative differences and then, the Tukey's test was performed to estimate outliers among clones of each municipality.
Description: El presente trabajo se desarrolló en Corpoica cuyo marco global se ejecutó en el macro proyecto titulado “PROTOCOLO PARA EL DESARROLLO DE PRODUCTOS CON VALOR AGREGADO PARA MERCADOS NACIONAL E INTERNACIONAL (primera aproximación)”. El objetivo de este trabajo fue validar un método espectrofotométrico visible para la determinación del contenido de pectina en la cáscara de seis clones distintos de Theobroma cacao L (ICS 60, TSH 565, ICS 95, EET 8, CCN 51, SCC 61) de seis Municipios, de los departamento del Tolima, Huila y Santander. El estudio comprendió cinco etapas: la primera es la selección de los materiales de cacao, según el estado de madurez y apariencia de los clones objeto de estudio. En la segunda se caracterizó los clones utilizando la metodología propuesta por el CATIE, encontrando que los clones más robustos son procedentes del municipio de Algeciras. En la tercera se realizó el pretratamiento del material biológico, el cual se procesó a una temperatura de 40 ºC eliminando componentes volátiles y humedad, con las secciones del fruto de cacao seco se prosiguió a molienda y tamizado, reduciendo el tamaño de partícula a 0,5 mm para ser almacenadas y codificadas. La matriz seca y tamizada se prosiguió a extraer pectina siguiendo la metodología propuesta por Mollea y col. y Emaga y col. modificada, y la cuantificación de la pectina se basó en la metodología propuesta por Blumenkrantz y Asboe-Hansen, e Ibarz y col. Finalmente en la última etapa de la validación se estableció los criterios según la norma técnica colombiana NTC-ISO/IEC 17025 del 2005, donde se tuvo en cuenta la guía (apéndice K) de la AOAC para validar métodos botánicos y suplementos dietarios para cuantificación de componentes mayoritarios. Donde se evaluó linealidad, límite de detección, límite de cuantificación, selectividad, precisión y exactitud. La linealidad se calculó mediante la curva de calibrado con un intercepto de 0,00382, una pendiente de 0,00942, un coeficiente de correlación de 1,00, un coeficiente de determinación 1,00, además, para estimar la linealidad mediante análisis estadístico, se realizó la prueba de t-Student, con n-2 grados de libertad obteniendo un valor de 199,98 y fue comparado con un valor t tabulado para un nivel de confianza requerido del 95% igual 2,776, comprobando la linealidad del sistema. Se determinó los límites de confianza de la pendiente en 0.00942±0,0000156 y del intercepto en 0,00382±0,000607. El límite de detección obtenido por la respuesta de doce blancos fue de 5,62 mg/L. El límite de cuantificación determinado fue de 6,96 mg/L. La selectividad se estableció mediante el procesamiento de los espectros de absorción del blanco de reactivos, el estándar ácido α-D-galacturónico y de dos clones por municipio, obteniendo un máximo de absorción de 523 nm, tanto para el estándar como para los clones. Sin embargo, por rigurosidad analítica se realizó la corrección propuesta por Kintner y Van Buren (1982) modificada, para estimar el contenido de α-D-GalA en la pectina. Para ello, se realizó una curva de calibrado de glucosa (único carbohidrato neutro revelado por CCF), y a partir de la curva de glucosa, se construye el factor de corrección obtenido mediante la razón de la absorbancia del blanco y la absorbancia generada por la concentración de Glc. La precisión del método analítico se evaluó sobre el sistema y sobre el método en condiciones repetitivas y reproducibles. La precisión del sistema se determinó con tres concentraciones diferentes del estándar y se obtuvo en condiciones repetibles y reproducibles, obteniendo un CV≤ 5%. La precisión del método se determinó mediante el clon EET 8 de Chaparral por quintuplicado en condiciones repetibles y reproducibles, obteniendo un CV≤ 5. La exactitud se evaluó en el sistema y en el método. La exactitud del sistema, se determinó para tres concentraciones diferentes del estándar α-D-GalA y se obtuvo un error relativo menor al 5% y un CV≤ 5%. Para la exactitud del método se eligió al clon CCN 51 de Villarrica para ser enriquecido a tres niveles de concentración, obteniendo un porcentaje de recuperación del 99%. Además, se estimó la exactitud mediante la prueba de t-Student, con n-1 grados de libertad para un nivel de confianza del 95%, concluyendo que no hay diferencia significativa entre la recuperación de la media obtenida y el 100 %. En la determinación de la matriz de estudio, primero se determinó la estabilidad del complejo 5FFA/MHDF, para conocer el tiempo de lectura donde presenta menor error. Posteriormente se cuantificó por triplicado, cada una de las cuatro réplicas de campo. Finalmente se realizó el análisis de varianza para estimar si los clones presentan diferencias significativas, y luego la prueba de Tukey se usó para conocer específicamente cuales clones presentan los valores atípicos en cada municipio y comparando para los distintitos municipios.
URI: http://hdl.handle.net/11349/14460
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